(军事医学科学院基础医学研究所, 北京 100850)
董邦权 金伯泉
(第四军医大学免疫学教研室, 西安 710032)
获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的一种严重的恶性传染病, 它主要经输血或血液制品传播。 目前全球有2 000余万HIV携带者, 我国HIV感染者已从1993年底的约1万人上升至1995年底的10万人左右, 而且还有进一步蔓延的危险。 因此, HIV感染检测方法的建立、 发展与完善在我国有着特殊重要的意义, 日益受到国家的重视。
本研究室在应用原核表达体系成功地表达HIV穿膜蛋白gp41, 核心抗原pG1和p24等一系列重组抗原的基础上［1, 2］, 以pG1免疫Balb/c小鼠制备出5株可特异性识别HIV p24的McAb, 并利用其中两株作用于不同抗原表位的McAb, 建立了检测HIV p24的夹心ELISA法, 对其临床应用进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 抗原、 细胞系及实验动物 重组抗原pG1, pG2及p24由本室韩保光博士提供。 pG1包含有p24氨基酸序列全长(231个氨基酸)以及p17的13个氨基酸和p15的74个氨基酸; 而pG2则仅由p24 C-端的151个氨基酸, p15 N-端的74个氨基酸组成, 与pG1相比其不含p17序列, 并缺失了p24 N-端的77个氨基酸［２］。 pG1与pG2都在N端与C端分别融合了载体上的12与22个氨基酸。 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0由本所陈勇老师惠赠; 8周龄雌性Balb/c小鼠购自本院实验动物中心。
1.2 杂交瘤细胞株的建立及腹水制备 取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞以50%PEG促融。 培养至第10 d以间接ELISA法筛选阳性孔, 有限稀释法克隆化3次至克隆生长孔100%阳性建株。 Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡(0.5 ml/鼠), 10 d后腹腔注射杂交瘤细胞1×106个/鼠制备腹水。
1.3 McAb的特性鉴定
1.3.1 特异性鉴定 p24抗原经SDS-PAGE分离, 按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将蛋白带转移至硝酸纤维膜上, 封闭后分别以5株McAb与膜反应, 然后再加入HRP-羊抗鼠IgG结合物继续反应, 最终以DAB系统显色。 所用Western印迹的具体方法参照文献［３］。
1.3.2 交叉反应性试验 以pG1, pG2, p24, HBcAg, HCV核心区(C区)和非结构区NS-3区, 以及大肠杆菌提取蛋白分别包被聚苯乙烯板, 以间接ELISA法测定5株McAb的交叉反应性。
1.3.3 McAb的效价测定及IgG亚类鉴定 以间接ELISA法测定5株杂交瘤细胞培养上清和腹水的抗体效价,由第四军医大学免疫学教研室协助完成。 小鼠Ig亚类ELISA试剂盒为Gibco公司产品。
1.3.4 McAb作用表位的鉴定 5株McAb腹水经protein-A亲和层析柱纯化, 改良的过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP)。 以pG1抗原2 mg/L包被聚苯乙烯板, 将浓度为400 mg/L的5株未标记McAb作10倍连续稀释后,与5株相同的HRP-McAb逐一配对等量混合, 加入ELISA板(100 μl/孔)。 37℃温育1 h后洗涤3次, 加OPD底物液显色10 min, 以1 mol/L的H２SO4终止反应, 测OD490 nm值。 作竞争抑制曲线判定5株McAb的作用表位。
1.4 双抗体夹心法的建立
1.4.1 方法建立 根据表位测定结果, 选择针对p24上不同表位的两株McAb, 以2G10为包被抗体, HRP标记的3H5作为酶标记McAb, 建立夹心ELISA法: 即以McAb 2G10(10 mg/L)包被聚苯乙烯板, 4℃过夜, 洗涤3次后加2%BSA封闭液进行封闭(4℃ 8 h)。 甩干封闭液, 干燥后真空封装保存于4℃。 使用时加入标准品和待检HIV抗体阳性血清(100 μl/孔), 37℃水浴温育1 h, 洗涤3次加入HRP-3H5 37℃水浴继续温育1 h, 洗涤5次后拍干, 加入OPD底物液, 37℃显色10 min后, 以1 mol/L H2SO4终止反应, 测定OD490值。
1.4.2 灵敏度测定 将纯化的p24抗原做倍比稀释, 测定本法的检测下限。
1.4.3 初步应用 采用上述建立的方法检测HIV抗体阳性血清标本24份, 根据标准曲线判定p24抗原的含量。
2 结 果
2.1 分泌抗p24 McAb杂交瘤细胞株的建立 采用淋巴细胞杂交瘤技术建立了5株分泌抗HIV p24特异性McAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为D3, 1H1, 2G10, 3H5和4H6。 体外连续传代培养3月以上及冻存复苏后, 仍保持持续稳定分泌特异性McAb的能力。 腹腔注射杂交瘤细胞7 d后开始收获腹水, 腹水及培养上清McAb的效价, 以及IgG亚类、 轻链类型的测定结果见表1。
表1 抗p24 McAb的Ig亚类及效价测定
Tab 1 Ig subclasses and titers of five McAbs to HIV p24
2.2 McAb的特性鉴定
2.2.1 特异性鉴定 Western blotting的结果表明, 5株McAb可与重组p24抗原发生特异性反应(图1)。 间接ELISA结果显示, 5株McAb与HBcAg, HCV C区, NS-3区, 以及大肠杆菌蛋白均不发生交叉反应。 但这5株McAb不但与pG1而且与p24均可发生较强的反应, 只有2G10和3H5两株McAb与pG2有较强的反应。 表明这5株McAb均可特异性地识别HIV p24分子上的抗原表位, 而不是针对pG1分子两端p15, p17,以及载体部分氨基酸序列上的抗原表位的。 2G10和3H5识别的表位位于p24蛋白C端151个氨基酸序列之上; D3, 1H1和3H5识别的表位位于N端的80个氨基酸上。
2.2.2 作用表位的鉴定 竞争抑制法结果表明, 5株McAb共识别3个不同的表位: D3, 1H1和4H6识别同一表位; 2G10和3H5分别识别两个不同的表位(图2,见第Ⅴ页)。 上述结论与5株McAb同pG1, pG2和p24反应的结果相符合。
图1 5株McAb特异性识别重组p24的Western blotting结果
Fig 1 Western blotting results of recombinant HIV p24 specifically identified by five McAbs
2.2.3 "夹心"ELISA法的建立及初步应用 我们应用2株识别不同表位的McAb建立了检测HIV p24抗原的夹心ELISA法, 检测下限可达1 μg/L左右(图3)。 检测的24份HIV抗体阳性血清中, 无一份p24抗原呈阳性。
3 讨 论
3.1 p24抗原检测的应用前景 HIV-1感染机体后, 感染者血液中最早出现的是病毒gag基因表达产物p24抗原, 然后才出现相应的特异性抗HIV抗体, 以后随抗体滴度的升高p24抗原含量呈逐渐下降的趋势, 以至检测不出。 在病情发展后期, 病毒大量复制, 机体免疫力下降, 所产生的抗体不足以中和病毒抗原时, p24抗原在血中又可测出［４］。 尤其值得注意的是HIV阳性母亲所生育的婴儿30%可能已受到感染,但由于婴儿体内母源性抗HIV抗体可持续13月~21月之久［5, 6］,常规检测抗HIV抗体不适用于婴儿,而p24抗原的检测则可弥补这一不足。
图3 夹心ELISA法检测HIV p24的标准曲线
Fig 3 Standard curve of the sandwich ELISA for detection of HIV p24
p24抗原的测定主要应用于HIV感染早期, 可缩短病毒感染至测出的窗口期至12 d~15 d［７］。 除此以外, 其还可用于监测AIDS病情发展, 预后判断以及评价抗HIV药物的疗效等方面［８］。
3.2 存在问题与展望 由于p24抗原在HIV感染者血清中含量很低(一般在0~500 ng/L左右, 极少数可达到mg水平［９］)和抗原-抗体复合物的形成也可影响其测定, 因此检测中所面临的最大问题是, 方法的敏感性高低能否满足检测的需要。 国外在这方面已进行了很多研究, 美国FDA已规定, 自1995年8月起, 所有全血、 成份血、 白细胞和原料血浆的献血员, 在献血前必须进行HIV-1抗原的筛选。 当前国内还没有国产的HIV p24检测试剂盒供应, 所需产品均需进口, 但因价格昂贵限制了其应用。
本研究制备了5株抗HIV p24的McAb, 利用2株识别不同表位McAb建立了检测p24抗原的夹心ELISA法, 该方法具有很好的稳定性。 其中以2G10为包被抗体, 以3H5为酶标记抗体的组合敏感性最高, 对p24抗原的检测下限可达1 mg/L左右。 目前已应用该法检测了24份抗HIV抗体阳性的血清, 无一份p24抗原检测呈阳性。 其原因有3种可能性: 首先为储存时间过长造成样品的HIV-1核心抗原p24已经降解; 其次因样品中p24抗原与相应的特异性抗体结合形成抗原-抗体复合物而影响了检测; 最后是因样品中p24抗原含量过低而未检出。本检测法的敏感性还不能满足实际检测的需要, 现正在进一步筛选高亲和力的McAb, 并同时研制Streptavidin-biotin系统, 以进一步提高本法检测的敏感性。
参考文献
1 吴卫星, 孙中和, 王鸿雁, 等. 用重组HIV gp41抗原检测艾滋病患者血清中的抗体. 中华流行病学杂志, 1992; 13(特刊2): 320
2 韩保光, 孟 莉, 邹民吉, 等. 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、 纯化及鉴定. 中华微生物学和免疫学杂志, 1996; 16(4): 239
3 鄂 征, 主编. 组织培养和分子细胞学技术. 北京: 北京出版社, 1995: 419
4 Morrow CD, et al. Viral gene products and replication of the human immunodefficiency virus. Am J Physiol, 1994; 266(35): c1135
5 Palasanthiran P, et al. Early detection of human immunodefficiency virus type Ⅰ infection in Australian infants and risk of perinatal infection and factors affecting transmissing. Pediatr Infect Dis J, 1994; 13(12): 1083
6 Ugen KE, et al. Diagnosis and prediction of pediatric HIV-1 infection and AIDS: current status. J Clin Lab Anal, 1994; 8(5): 309
7 Dodd RY. Transfusion transmitted HIV. Vox Sang, 1996; 70(Supp13): 1
8 刘荷中, 凌世淦. HIV感染检测技术及应用的研究进展. 国外医学流行病学传染病学分册, 1996; 23(3): 126
9 Varnie OE, et al. High quantifiable levels of p24 antigenemia are detectable in HIV type Ⅰ-infected patients. AIDS Res Hum Retroviruses, 1996; 12(7): 565
(收稿 1997-02-04 修回 1997-04-02)
图2 酶标记抗体竞争结合试验的结果
Fig2 Results of HRP-labeled McAb competitive binding assay
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作者简介: 刘荷中, 男, 26岁, 硕士生
